Aflatoksin B1 (AFB1) dihasilkan terutama oleh fungi Aspergillus flavus dan bersifat sangat toksik serta karsinogenik. Sapi perah yang mengkonsumsi pakan tercemar AFB1 dapat menghasilkan susu yang mengandung residu aflatoksin (AFM1). Penelitian ini bertujuan mengetahui kejadian cemaran AFB1 pada pakan sapi perah serta AFM1 pada susu segar dan susu olahan di D.I. Yogyakarta. Hasil penelitian memperlihatkan 100% sampel pakan mengandung AFB1 dengan kisaran 4 – 85 ppb. Residu aflatoksin ditemukan pada 90% susu segar dengan kisaran 24 – 417 ppt, sedangkan pada susu segar olahan diketahui 100% sampel mengandung AFM1 dengan kisaran 100 – 244 ppt. Pengujian sampel susu rekombinasi sebagai pembanding menunjukkan 100% sampel mengandung AFM1 dengan kisaran 99 - 161 ppt. Hasil ini memperlihatkan tingginya tingkat dan kejadian cemaran AFB1 dalam pakan yang menyebabkan tingginya kejadian susu mengandung residu aflatoksin. Tingginya kadar AFM1 dalam survei ini menunjukkan besarnya resiko konsumen terhadap dampak negatif paparan aflatoksin melalui konsumsi susu.