Air tebu diketahui mengandung sukrosa yang dapat meningkatkan energi bagi motilitas spermatozoa. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan air tebu dan kuning telur dalam mempertahankan kualitas spermatozoa asal kauda epididymis sapi persilangan. Penelitian ini menggunakan epididimis sapi persilangan dari rumah pemotongan hewan (RPH) Basirih Kotamadya Banjarmasin. Spermatozoa yang dikoleksi ditempatkan ke dalam empat tabung reaksi masing-masing terdiri dari: 80% pengencer laktosa + 20% kuning telur ayam ras (kontrol), 45% air tebu + 45% akubidestilata + 10% kuning telur ayam ras (ATKT10), 42,5% air tebu + 42,5% akubidestilata + 15% kuning telur ayam ras (ATKT15), dan 40% air tebu + 40% akubidestilata + 20% kuning telur ayam ras (ATKT20). Parameter pengamatan adalah motilitas, daya hidup, dan membran plasma utuh. Hasil penelitian menunjukkan motilitas pengencer kontrol (65%), berbeda nyata (P<0,05) dengan ATKT10 (49%), ATKT15 (48%) dan ATKT20 (54%), namun demikian ATKT20 masih lebih tinggi (P<0,05) dengan ATKT10 dan ATKT15. Persentase daya hidup spermatozoa berbeda nyata (P<0,05) antara kontrol (79,60%) dengan ATKT10 (72,40%), ATKT15 (73,20%), dan ATKT20 (74,60%), akan tetapi ATKT20 dan ATKT15 masih lebih baik (P<0,05) dari ATKT10. Untuk persentase MPU, kontrol sebesar 76,4%, sama dengan (P>0,05) perlakuan ATKT 20 sebesar 76%, akan tetapi persentase MPU kontrol masih lebih baik (P<0,05) dari ATKT 10 sebesar 71,80% dan ATKT15 sebesar 74,20%. Dari hasil penelitian ini, terlihat kemampuan air tebu mampu mempertahankan motilitas spermatozoa sampai dengan dua hari. Kata Kunci : air tebu, sapi persilangan, spermatozoa asal kauda epididimis